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TECNOLOGIAS TRATAMIENTO DE RESIDUOS SOLIDOS |
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Valorización de residuos sólidos de curtiembre Hidrolizado de colágeno: 'piel soluble' aplicada en los procesos de poscurtición I: su caracterización |
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Publicado anteriormente en Tecnología del Cuero, Año 9, nº 36, 17-27 |
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Resumen Valorizar
los residuos sólidos de naturaleza proteica significa
cambiar la modalidad de "tirar" las proteínas
y considerar su reutilización, por ejemplo, en tecnología
agropecuaria y como materia prima para la elaboración
de productos industriales. El
tratamiento de las virutas de cromo a través de una
hidrólisis alcalina-enzimática permite obtener un
hidrolizado de colágeno y recuperar, por disolución de
la denominada 'torta de cromo', el material curtiente. El
hidrolizado de colágeno aplicado en la elaboración de
cuero manifesta una acción de sinergia con los
recurtientes, además de exhibir un efecto "cosmético-lubricante"
que enaltece las propiedades de la flor del cuero y
otorga una mayor blandura mejorando la resistencia del
tejido fibroso. Asimismo, muestra un 'efecto
restaurador' de la superficie flor del cuero
semiterminado disimulando los defectos de conservación
y marcas originales de la piel. La interacción con los
colorantes se manifiesta intensificando los colores y en
teñidos homogéneos. Para
una mejor comprensión de las interacciones entre el
hidrolizado de colágeno y los agentes de los procesos
de la poscurtición, o bien para elaborar compuestos
derivados hacia fines específicos es importante conocer
aspectos de la reactividad de la mezcla de los polipéptidos
que conforman al hidrolizado de colágeno. En
el presente trabajo se expone un protocolo de análisis
para la caracterización del hidrolizado de colágeno
que nos brinda datos relevantes tanto para ser empleados
en el control del hidrolizado de colágeno elaborado
como para el diseño apropiado de distintas
aplicaciones. I.-
Introducción Considerando
que una actitud preventiva puede desempeñar un papel
importante antes de adoptar medidas correctivas globales
sobre los distintos problemas que nos presentan los
efluentes líquidos, gaseosos y residuos sólidos de la
curtiembre, las acciones evitar; minimizar; recircular y
valorizar tienen que formar parte en la selección de
las denominadas 'tecnologías más limpias'. Actualmente
la disposición apropiada de los residuos sólidos
generados en la elaboración de cueros es uno de los
principales aspectos técnicos-económicos, vinculados a
la relación curtiembre-medio natural, que enfrenta la
industria. Considerando
el resultado promedio de un balance de los residuos sólidos
en el estado en que éstos se originan, por cada 1000
kg. de piel vacuna salada sólo se convierten en cuero
el 26%; mientras que en términos de colágeno, el
aprovechamiento de esta proteína como material cuero es
del 50%. Mostrándose así, por una parte, la baja
eficiencia en la producción de cueros, y por otra, el
gran potencial para el reaprovechamiento de los residuos
proteicos, lo que conlleva a reducir la carga
contaminante y facilitar la disposición de los desechos
sólidos. Un
residuo sólido puede disponerse según las siguientes
alternativas:
Valorizar
los residuos sólidos -de naturaleza proteica- significa
cambiar la modalidad de "tirar" las proteínas,
como se señala en la alternativa 1, y considerar su
reutilización, por ejemplo, en tecnología
agropecuaria; así como materia prima para la elaboración
de productos industriales, los cuales pueden orientarse
hacia la misma curtiembre (reciclaje). Teniendo
en consideración la curtiembre, es a través de la
alternativa 2 que tienen que desarrollarse tecnologías
que permitan de los residuos 'recuperar la piel en un
estado soluble' e "introducirla en el cuero",
para elaborar mejores cueros. En
este contexto, el tratamiento de las virutas de cromo y
recortes de cuero en estado wet blue mediante, por
ejemplo, una hidrólisis alcalina-enzimática permite
obtener un hidrolizado de colágeno y recuperar, por
disolución de la denominada 'torta de cromo', el
material curtiente. Sólo se indicarán aquí algunas
referencias con respecto al tratamiento de las virutas;
en cada una de ellas pueden encontrarse numerosas
referencias que ilustran los diferentes procesos de hidrólisis
[1-7]. Independientemente
del procedimiento empleado, la hidrólisis de las
virutas de cromo conduce a dos productos:
II.-
Aplicaciones del hidrolizado de colágeno En
la valorización de un residuo sólido, la aplicación
comercial de los subproductos obtenidos es la clave para
hacer atractiva cualquier alternativa tecnológica de
tratamiento. En el caso particular de la degradación de
las virutas de cromo el uso del hidrolizado de colágeno
es la fuerza impulsora para el emprendimiento de un
proyecto, teniendo en consideración la cantidad
generada y la potencial diversidad de aplicaciones, y
que las sales básicas de cromo -obtenidas de la 'torta
de cromo'- pueden ser utilizadas sin dificultades
asistiendo a los agentes curtientes 'frescos' [6]. Por
cada kilogramo de virutas de cromo secas se originan
aproximadamente 1,7 Kg de solución de hidrolizado de
colágeno al 40% p/p [4]. Para una curtiembre que
procesa 1000 pieles por día se producen alrededor de
2,3 toneladas diarias del hidrolizado, lo que obliga a
ser creativos en la búsqueda de alternativas de uso. Con
el propósito de señalar ejemplos que ilustren las
diversas aplicaciones puede mencionarse aquí, ampliando
la descripción de los usos realizada en la sección
anterior, que el hidrolizado puede emplearse en tecnología
agropecuaria como fertilizante, y como ingrediente en
dietas balanceadas para animales [8,9,10,11]; sus
propiedades activas vinculadas a su funcionalidad química
pueden ser aprovechadas en las formulaciones de
adhesivos [12]; cuando la hidrólisis es moderada (proteína
gelatinizable), las propiedades físicas y químicas del
hidrolizado son aceptables para los usos técnicos de
gelatinas [13], y cuando estas gelatinas son tratadas en
resinas de intercambio iónico, se obtienen productos
-que entre otros usos- pueden utilizarse en cosmética,
adhesivos, fotografía, y en la síntesis de polímeros
injertados (graft-polymers). Derivados proteicos del colágeno
en forma de películas (films), microemulsiones, ó
microcápsulas pueden aplicarse como componente básico
en el 'empaquetamiento' de diversos materiales [14]; películas
preparadas con gelatinas tratadas con glutaraldehído
pueden emplearse para inmovilizar una enzima [15],
asimismo, la polimerización del hidrolizado con
formaldheído conduce a productos con propiedades
curtientes-recurtientes [16,17] ; también los
hidrolizados gelatinizables han demostrados buenas
propiedades para estabilizar emulsiones [18], y como
inhibidores de corrosión [19]; microesferas de
gelatinas tratadas con aldehídos pueden usarse como vehículo
de componentes donde se requiere biodegradabilidad del
soporte y desprendimiento lento de compuestos [20]; en
la referencia [21] se exponen otras aplicaciones en la
industria de la goma y la madera . Las referencias [12
-15] y [17-19] fueron extraídas de la referencia [22]. III.-
Usos del hidrolizado de colágeno en la industria de
cuero Con
relación a la aplicación del hidrolizado de colágeno,
el CITEC orientó sus estudios de investigación y
desarrollo hacia su utilización en tecnología del
cuero, avanzando dos alternativas de uso: fabricación
de agentes recurtientes de base "acrílico -
proteico" ('copolímero' obtenido al emplear el
hidrolizado en la síntesis de los mismos), y el uso
directo del hidrolizado en los procesos de poscurtición:
recurtido, tintura y engrase. Los
primeros trabajos experimentales se dirigieron hacia el
empleo de los recurtientes acrílicos-proteicos HCM 105
y HCM 106 (desarrollados con la colaboración de la
empresa argentina Cahesa s.a.) en el proceso de
recurtición, conjuntamente con el hidrolizado de colágeno
adicionado en el proceso de engrase. Hasta el presente
se han realizado experiencias a escala planta piloto, y
en producción en curtiembres que elaboran cueros plena
flor para tapicería, y capellada; y descarnes para
cinturones. Los primeros resultados experimentales
fueron publicados en las referencias [3,4,23]. Los
estudios a escala piloto [3] pusieron en evidencia las
buenas aptitudes de los agentes recurtientes
desarrollados. Asimismo, el hidrolizado de colágeno
manifestó una acción de sinergia con los recurtientes
utilizados en las formulaciones; además exhibe un
efecto "cosmético-lubricante" que enaltece
las propiedades de la flor del cuero, y otorga a éste
una mayor blandura. Resultados
experimentales aún no publicados, obtenidos en planta
piloto curtiembre, ponen en evidencia un 'efecto
restaurador' de la superficie flor del cuero
semiterminado, disimulando los defectos de conservación
y las marcas originales de la piel. El
hidrolizado de colágeno manifestó también un
comportamiento interesante con relación a las
propiedades físico-mecánicas -en particular sobre la
resistencia al desgarramiento- al incrementar la
resistencia del tejido fibroso ('efecto nutriente'),
observándose una acción sinergética con los
recurtientes de base acrílica. Este comportamiento
sobre la estructura fibrosa, como el efecto agradable
sobre la apariencia y tacto de la superficie flor también
ha sido destacado por otros autores [24,25,26]. El
incremento de los valores asignados a las propiedades
blandura y plenitud, así como la mayor intensidad de
los teñidos, logradas en diferentes artículos,
sugieren que las interacciones hidrolizado de colágeno-recurtientes/engrasantes/tinturas
debieran ser sistemáticamente estudiadas para mejorar
la calidad de los cueros semiterminados, y lograr un
mejor aprovechamiento de los insumos químicos en los
procesos de poscurtición. IV.-
Caracterización del hidrolizado de colágeno Las
alternativas de uso del hidrolizado de colágeno
mencionadas, y en especial sus aplicaciones en la
elaboración de distintos tipos de cueros requieren, ya
sea para una mejor comprensión de las aplicaciones
realizadas; para el diseño de nuevos usos; para un análisis
detallado de las interacciones entre el hidrolizado de
colágeno y los agentes de los procesos de la poscurtición,
o bien para elaborar compuestos derivados hacia fines
específicos, de un conocimiento sobre la reactividad de
la mezcla de los polipéptidos que lo conforma. Las
propiedades químicas del hidrolizado de colágeno
quedan determinadas, al igual que en su 'proteína
madre', el colágeno, principalmente por la presencia
-entre otros grupos activos- por los grupos carboxílicos
y aminos. En el hidrolizado de colágeno, además de los
grupos presentes en las cadenas laterales iónicamente
activas, debemos tener en consideración aquellos que
aparecen como resultado de la hidrólisis alcalina/enzimática
de las uniones peptídicas. La
caracterización que se expone se realizó sobre el
hidrolizado resultante de la conversión: "colágenos-complejos
de cromo(III)" a hidrolizados aplicando la tecnología
que se propuso para el procesamiento de las virutas [3].
No se analiza ninguna de las transformaciones que
afectan las uniones inter-intra cadenas que han tenido
lugar en la transición mencionada. Si
definimos al término "gelatinas" -siguiendo a
A.Veis [27]- como las proteínas obtenidas de las proteínas
colágenos por diferentes procedimientos que involucran
la destrucción de las estructuras secundarias del colágeno,
y de acuerdo a E. Heidemann [28] como aquellos derivados
proteicos que presentan una consistencia de gel
("bloom values") como mínimo de 100 (se ha
demostrado que para lograr una consistencia de gel se
requieren fracciones de alrededor de 100.000 Dalton de
peso molecular), el hidrolizado de colágeno obtenido
-con pesos moleculares entre 5.000 a 10.000 Dalton- no
debe ser considerado una clase de gelatinas. Se define a
la mezcla de polipéptidos resultante de la hidrólisis
intensa del colágeno como "hidrolizados de colágeno". Protocolo
de análisis Durante
el desarrollo de la tecnología de procesamiento de las
virutas y las aplicaciones del hidrolizado de colágeno
en tecnología del cuero se adoptó el siguiente
protocolo de análisis:
Los
datos que se exponen en el trabajo corresponden al tipo
de hidrolizado que se obtiene en la planta piloto CITEC
con capacidad para procesar 100 kg de virutas de cromo
en cada batch. Cromatograma
en geles de permeación (gel Sephadex G-10) El
primer control que se adoptó para verificar la
reproductibilidad de las partidas de hidrolizado de colágeno
elaboradas en planta piloto, fue la obtención de un
cromatograma en columnas de permeación por geles de
Sephadex. Para
lograr una apropiada resolución de las bandas con fines
analíticos se llevó a cabo un estudio sistemático
sobre las variables relevantes de la cromatografía por
geles de permeación, como por ejemplo: dimensiones de
la columna (volumen del lecho), naturaleza de los geles
(tamaño de partícula, porosidad, grado de
entrecruzamiento), composición y velocidad de la fase móvil,
concentración y volumen de la muestra sembrada. Las
condiciones experimentales adoptadas fueron las
siguientes:
La
figura 1 exhibe el cromatograma típico del hidrolizado
de colágeno elaborado por CITEC. En el cromatograma
puede observarse la aparición de tres bandas con
aceptable resolución, y los correspondientes valores de
los coeficientes de partición (Kav). |
LA OPINION DE DSOSTENIBLE NO NECESARIAMENTE COINCIDE CON LA OPINION DE LOS COLUMNISTAS. A RAIZ DE CUALQUIER NOTA PUBLICADA EN ESTA PAGINA SE CONCEDERA DERECHO A REPLICA A QUIEN LO SOLICITE CON LA FINALIDAD DE MOSTRAR OTRO ENFOQUE SOBRE EL MISMO TEMA, ENRIQUECIENDO DE ESTA MANERA, LOS DEBATES QUE SE GENEREN. |
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TECNOLOGIAS
TRATAMIENTO DE SOLIDOS
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datos de los coeficientes de partición de los hidrolizados elaborados se
encuentran en el rango: Kav1 0,06 ± 0.02 Kav 2* 1 0,64 ± 0.06 Kav 3* 1 1,07 ± 0.05 En la figura 1 también se indican las áreas de las bandas, las cuales, si se asume que la sensibilidad en la detección de los distintos componentes de la mezcla de polipéptidos es similar, representan las cantidad de los mismos en las diferentes bandas. banda1 74,3 % banda2 19,2 % banda3 6,5 % Teniendo en consideración los modelos gráficos desarrollados por Snyder L.R. [29] basados en cálculos matemáticos de las bandas Gausianas de acuerdo a la ecuación de resolución R = 2(t2 - t1) / (w1 + w2), donde R -la resolución- es igual a la diferencia en los tiempos de retención para dos bandas dividido por el promedio de la línea base de las bandas en unidades de tiempo, puede concluirse que se ha obtenido una resolución buena para los pares de bandas adyacentes. resolución banda1-2 R = 1,0 resolución banda2-3 R = 1,0 Asimismo, los
modelos permiten estimar la pureza de cada una de las bandas superpuestas para
el caso donde cada banda es recuperada en 'igual pureza'. En las líneas de
corte, obtenidas trazando una perpendicular al eje de los tiempos a partir del
punto medio del valle entre dos bandas y utilizadas en la figura 1 para
determinar el área, se indica la pureza con la cual es posible aislar cada una
de las bandas, en el caso de que se desea las separación de las mismas [29].
banda1 y banda2 se pueden recuperar a una pureza
del 98%
banda2 y banda3 se pueden recuperar a una pureza
del 98% Las bandas 2 y 3
presentan tiempos de retención cercanos a la elución del cloruro de cobalto
utilizado para obtener el Vt de la columna; este hecho hace imposible el uso de
las columnas de permeación para desalinizar al hidrolizado de colágeno.
Asimismo, el desalinizado no pudo lograrse ni por diálisis ni por resinas de
intercambio. La precipitación fraccionada empleando solventes con diferentes
polaridad tampoco permitió la separación de los componentes 'proteicos' de
las sales presentes en el hidrolizado. . El contenido de sales, principalmente
sales neutras cloruro y sulfato de sodio, puede encontrarse en el rango 25 - 30
% -porcentaje referido al peso de sólidos totales- (cloruro de sodio 1/3,
sulfato de sodio 2/3). Los análisis que
se describen en los puntos siguientes se realizaron sobre el hidrolizado de colágeno
tal cual es obtenido y utilizado en tecnología del cuero. La
mezcla de polipéptidos fue evaluada por la reacción de 'biuret'. El contenido
de componentes derivados de la degradación del colágeno fue expresado como mg
de 'proteína equivalente'/mg de sólidos totales. Este valor fue tomado de
referencia para expresar los resultados de los grupos reactivos del
hidrolizado.
%
'proteína equivalente' en hidrolizado de colágeno = 0,66 ±
0,02 mg / mg sólidos totales
(coeficiente
de variación cv = 3.7 %) El
dato corresponde al valor promedio (9 determinaciones) y su dispersión del
hidrolizado de colágeno utilizado en la titulación ácido-base que se
presenta a continuación. Curvas
de titulación del hidrolizado de colágeno El
estudio de las curvas de titulación del hidrolizado de colágeno se llevó a
cabo para obtener información de la cantidad de grupos iónicos presentes a
través de la titulación de los mismos en medio ácido y alcalino, y realizar
una comparación con los valores obtenidos en la titulación de las gelatinas,
especialmente aquellas elaboradas en medio alcalino. Para
la confección de las curvas se siguieron las técnicas descriptas por Ames
[30] y de Kenchington y Ward [31] , diseñándose un programa basado en las
ecuaciones deducidas en estos artículos para procesar por computadora los
datos experimentales. Los resultados se presentan a través de las curvas de
titulación: consumo de ácido ó álcali por cada gramo de proteína (o 'proteína
equivalente' para el caso del hidrolizado de colágeno). Para
la interpretación de las curvas de titulación se tomaron de referencia el
criterio de Cannan [32] sobre el rango de pH en el cual cada grupo funcional es
titulado, las modificaciones introducidas por Kenchington [31] al reexaminar el
criterio propuesto por Cannan para superar las discrepancias observadas
especialmente en los valores de los grupos imidazolilos (cadena lateral del
aminoácido histidina) + (-amino en el estudio de las gelatinas, y el
procedimiento para la titulación de los grupos (-amino en hidrolizados
proteicos sugerido en United States Pharmacopeia XIX. Drug
Substances and Dosage Forms (Sörensen method). En la tabla I se indican los rangos de pH, sugeridos por ambos autores, en los que se titulan los grupos iónicos indicados. Tabla I Rango de pH para el análisis de las curvas de titulación de gelatina (*) |
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(*)
Arthur Veis "The macromolecular chemistry of gelatin". Molecular
Biology.An international seires of Monographs and Texbooks. Academic Press-New
York and London, page 102, 1964. Para la titulación se preparó
una solución disolviendo en 50 ml de agua bidestilada la cantidad de
hidrolizado de colágeno seco para aportar 0,5 g de 'proteína equivalente', el
pH de esta solución se ajustó a 7,00. La titulación se realizó con
soluciones de ácido clorhídrico 0,1 N, e hidróxido de sodio 0,1 N
adicionadas desde una microbureta y con agitación continua. Luego de cada
adición se deja reaccionar el sistema hasta lograr un valor del pH constante
(normalmente 2 min). En cada agregado se adiciona un determinado volumen de álcali/ácido
para obtener un cambio en el pH en el rango 0,15 - 0,20 . Para la titulación del agua
bidestilada se procedió de manera similar a la indicada para el hidrolizado de
colágeno. En la figura 2 se presenta una
curva de titulación típica del HCCITEC. En la Figura 3 se transcriben, del
libro de Gustavson K.H [33, pág. 104], las curvas de titulación de la
gelatina ('álcali precursor') y del colágeno (corium-nativo y corium
encalado) con fines comparativos. En el proceso de la degradación
hidrolítica de la gelatina se asume como modelo que el colágeno tiene un número
de uniones particularmente lábiles, y que cada una de ellas es rota durante la
formación de gelatina soluble, originando un sistema cuyas cadenas polipeptídicas
contienen sólo las uniones peptídicas más refractarias. A su vez la gelatina
contiene varios grupos de uniones peptídicas de diferentes energías libre de
hidrólisis: las uniones más reactivas se romperían primero dejando los
fragmentos de cadena progresivamente más resistentes a una hidrólisis
posterior [27, pág 224]. Ni en la hidrólisis alcalina a elevados pH (>10),
ni en la degradación con enzimas con actividad proteolítica (pepsina, papaína,
tripsina y quimotripsina) la proteólisis prosigue hasta ser completa: formación
de aminoácidos [27, pág 243]. En la Tabla II se presentan los
datos experimentales obtenidos de las curvas de titulación del hidrolizado de
colágeno, y aquellos correspondientes al colágeno y gelatina extraídos de la
bibliografía.
Tabla
II Interpretación de las curvas de
titulación del hidrolizado de colágeno (se incluyen valores para el colágeno encalado y gelatina) |
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* guanidino = grupos básicos totales - (imidazolio +
(-amino + (-amino) ** consumo máximo de álcali. Consumo máximo de álcali en
la gelatina 0,77 mmoles/g [27] *** cálculo para el hidrolizado de colágeno: guanidino =
consumo total de álcali - consumo entre pH 7,0-11,5 a.-
datos obtenidos de J.H Bowes y R.H. Kenten Biochem. J., 43, 365-372, 1948, y ., 43, 359-365, 1948 b.- datos obtenidos de K.H Gustavson
"The Chemistry and Reactivity of collagen" Academic Press, 1956, pág
112. c.- datos obtenidos de W.M. Ames [30] y referencia [27], pág
103,105,188. Criterio Cannan [31] d.- datos expresados en mmoles/g de 'proteína equivalente'
determinados por la reacción de 'biuret'. e.- Según la referencia [27 pág 189] los grupos (-amino en
el colágeno están involucrados en uniones covalentes intercadenas; las
condiciones experimentales del proceso de hidrólisis son suficientes para
hidrolizar la mayor parte
de estas uniones. La capacidad máxima de combinación en medio ácido es prácticamente
idéntica entre el colágeno y la gelatina, sin embargo en el rango de pH 2 - 5
la capacidad de aceptar protones en la gelatina es superior, lo cual
probablemente sea el resultado de la organización estructural de ambas proteínas
[34, pág 105]. La gelatina en solución contiene cadenas simples en las cuales
los grupos carboxílicos están libres para reaccionar, condición ésta que se
incrementa en el caso del hidrolizado de colágeno. Las diferencias indicadas para ambas proteínas (entre pH 2
y 5) se minimiza sustancialmente por la adición de cloruro de sodio, haciendo
a la solución del ácido clorhídrico 0,2M en esta sal [34, pág 105 y 35, pág
6]. En las figuras 2 y 3 puede observarse que del lado alcalino
hay un mayor consumo de álcali por parte de la gelatina y aún mayor por el
hidrolizado de colágeno en comparación al colágeno. El hecho experimental que el colágeno presenta un menor consumo del lado alcalino
puede ser debido a una mayor y más estable interacción de los grupos cargados
negativamente con aquellos de carga opuesta, posiblemente con los grupos
guanidinos [Gustavson, referencia 34, pág 105]; la interacción de los grupos
cargados ubicados en 'clusters' adyacentes (interacción iónica interna), o en
cadenas peptídicas (formación de puentes salinos-iónicos) dan mayor
estabilidad a la estructura fibrosa del colágeno [Heidemann, referencia 35]. De acuerdo a Bowes y Kenten [36] en la curva de titulación
de la gelatina en medio alcalino hay un incremento apreciable en el número de
grupos titulables en el rango de pH 5-9 correspondiente a la aparición de
grupos carboxílicos por la hidrólisis de los grupos amida. Considerando que los grupos imidazolilos + (-aminos son
titulados en el mismo rango que en el colágeno no tratado (no son afectados
por el tratamiento alcalino) y que el contenido de grupos imidazolilos es de
0,02 mmoles/g [36], el incremento observado en la titulación del hidrolizado
de colágeno para los ( aminos corresponde a la hidrólisis de las cadenas peptídicas. Los resultados obtenidos en el tratamiento de los datos
experimentales de la curva de titulación del hidrolizado de colágeno en
comparación con los datos para el colágeno y la gelatina se adecuan a las
interpretaciones de los cambios que experimenta el colágeno al ser sometido a
un proceso de hidrólisis alcalina-enzimática: incremento en el consumo de ácido/álcali
y en los grupos (- aminos. Se observó un notable aumento en la capacidad de
combinar álcali en el rango de pH correspondiente a los grupos (-aminos (+?),
y para los grupos guanidinos se ha observado una disminución desde el valor
0,45 mmoles/g para la gelatina a 0,25 mmoles/g para el hidrolizado de colágeno.
Atendiendo a los comentarios realizados por Veis [27, pág
200-202] el residuo arginina puede sufrir en medio alcalino fuerte un proceso
de deguanización transformándose el grupo guanidino en el residuo ornitina +
urea, y cantidades menores del residuo citrulina + amoníaco Determinación de grupos aminos La determinación de los grupos aminos totales se realizó
de acuerdo al método propuesto por Habeeb A.[37] empleando el reactivo ácido
trinitrobenceno sulfónico (TNBS), en el cual se determinan -en las condiciones
del ensayo- los grupos amino primarios libres ((-amino + los amino grupos de la
lisina e hidroxilisina) [38]. Para el hidrolizado de colágeno utilizado en la titulación
ácido/base se obtuvo el valor promedio 0,85 ( 0,04 mmoles NH2 totales/ g
'proteína equivalente' (9 determinaciones) Con los datos de la Tabla II correspondientes a los grupos
(-aminos y a los grupos (-aminos del colágeno: (grupos imidazolilos +
(-aminos) - grupos imidazolilos {0,04 - 0,02}, [31]; y el valor de los grupos
aminos totales determinados por el 'método TNBS', puede obtenerse el valor de
los grupos (-aminos (residuos N-terminales) generados en la hidrólisis
alcalina-enzimática.
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Figura 2
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Figura
3 Curva
de titulación de gelatina y colageno: I colageno encalado (corium); II colageno
nativo (desencalado); III alcali-precursor ( extraído del libro Gustavson K. H. "The Chemistry and Reactivity
of collagen " [34])
4 |
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Con
los grupos a-aminos
así calculados se puede derivar el grado de hidrólisis alcanzado, como así
también obtener una estimación del peso molecular numérico promedio para las
cadenas polipéptidas formadas
Los
a--aminos calculados a
través del dato analítico de los grupos aminos totales dieron un resultado
cercano al correspondiente valor de la curva de titulación. Grado
de hidrólisis: El
grado de hidrólisis (DH) se
calculó de acuerdo a la fórmula dada por Adler-Nissen [39]:
DH
= h/ h tot. 100 Donde: h
tot = número total de uniones peptídicas en la proteína en
mmoles/g proteína h tot = 11.1 mmoles/g proteína (valor para la gelatina, Adler-Nissen)
h = mmoles grupos aminos generados en la hidrólisis/g ‘proteína
equivalente’ hidrolizado
de colágeno h = grupos aminos totales /g ‘proteína equivalente’ hidrolizado de colágeno - e-amino /g proteína
gelatina - a-amino
/g proteína colágeno Resulta
también interesante comparar los datos de bibliografía sobre los números
totales de los residuos N-terminales obtenidos en la degradación térmica a
diferentes pH y en la degradación enzimática de la gelatina, con los valores
de esta proteína sin degradar, y aquellos obtenidos en CITEC para el
hidrolizado de colágeno. Estos datos están compilados en la Tabla III.
Tabla III Cambios en los residuos N-terminales totales en gelatina encaladaa (expresados en mmoles/ g proteína)
a.-
A. Courts Biochem J. 59, 382, 1955 (citado en Veis [27], páginas 238, 244) b.-
gelatina degradada a 75ºC durante 24 horas c.-
peso molecular numérico promedio, basado en la determinación de (-aminos
(residuos N-terminales) (1
x1000 / h (mmoles/g 'proteína equivalente' hidrolizado de colágeno). d.-
temperatura de hidrólisis 44ºC, tiempo 2,5 h e.-
hidrolizado de colágeno elaborado en CITEC [3] (hidrólisis alcalina-enzimática
NaOH-Alcalasa). A temperaturas superiores a 44ºC todas las
gelatinas pueden considerarse desprovistas de su estructura secundaria, y sus
cadenas peptídicas sin orientación preferencial; no es sorprendente por lo
tanto que estas cadenas puedan adaptarse a las configuraciones de los centros
activos de diferentes enzimas con actividad proteolítica [27,pag 243]. Los
datos de la Tabla III muestran precisamente el efecto notable de la acción de
enzimas proteolíticas -especialmente la tripsina-. El procedimiento utilizado para la elaboración
del hidrolizado de colágeno (hidrólisis alcalina-enzimática -Alcalasa pH
8,5-9,5) genera un hidrolizado con características similares a los presentados
en la Tabla III, la cual fue extraída del libro de Veis A. [27], páginas 238,
244). Determinación del punto isoeléctrico El valor del pH al cual una proteína no migra
cuando es sometida a un campo eléctrico es llamado 'punto isoeléctrico' (pHIE), punto en el cual el compuesto se encuentra con el mismo número de
cargas positivas que negativas: su carga neta resultante es cero. Este valor no
siempre es coincidente con el punto isoiónico debido a las condiciones
naturales en que se encuentra la proteína en cuestión: uniones con sales u
otros componentes cargados fijados a los grupos activos de la proteína; en el
colágeno está presente la situación descripta [35]. Cuando los grupos cargados se encuentran
balanceados electrostáticamente las moléculas exhiben un rango de pH en el
cual no presentan actividad. La reacción de ellas con ácidos ó álcalis
genera el dominio de centros cargados positiva ó negativamente dejando así
grupos reactivos libres para reaccionar. La determinación del punto isoiónico del
hidrolizado de colágeno resulta de interés en sus aplicaciones en la
manufactura de cuero para seleccionar las condiciones experimentales que
aseguren su uso apropiado en un proceso determinado. Una de las técnicas utilizadas para determinar
el punto isoeléctrico de polvo de piel cromado es el empleo de colorantes ácidos y básicos
no anfóteros en soluciones tamponadas cubriendo el rango de pH 3,6 - 8,0 (intérvalo
de pH 0,2 unidades). Luego del proceso de tintado y de la eliminación del
colorante no fijado, el rango de pH al cual el colorante "dejó de teñir"
(cambio distintivo en la coloración del sustrato) es asignado al valor del punto isoeléctrico
[40]. Heidemann [35], hace referencia a la
determinación de las cargas en macromoléculas utilizando la técnica
denominada 'detector del flujo de corriente de las partículas' (PSPD, Particle
Streaming Potential Detector), la cual es también una titulación empleando
oligómeros catiónicos y aniónicos. La transferencia de electrones por el
polielectrolito genera un flujo de corriente que es medido en un amperímetro.
En el punto de equivalencia de cargas no hay un flujo de corriente (punto isoeléctrico). Las dos técnicas señaladas indujeron a la
adaptación del método analítico desarrollado por Fraenkel-Conrat [41,42]
para determinar los grupos ácidos y básicos totales en proteínas empleando
colorantes básicos y ácidos no anfóteros. El método se basa en la capacidad que tienen
los grupos básicos/ácidos de las proteínas para unirse con colorantes en
soluciones ácidas o alcalinas tamponadas. El colorante combinado se determina
restando a la cantidad ofrecida la cantidad de colorante que no ha reaccionado,
la cual es medida espectrofotométricamente sobre el líquido final de la
reacción luego de separar por filtración el complejo colorante-proteína.
Para la evaluación de los centros activos ácidos se emplea el colorante
Safranina O y el colorante Orange G para los grupos básicos. El hidrolizado de colágeno, a diferencia de
las proteínas analizadas en la referencia [42], no precipita con los
colorantes indicados en las condiciones del método, por lo que fue necesario
encontrar condiciones apropiadas para utilizarlo en la determinación del punto isoiónico. En la técnica adaptada para el uso del
colorante Safranina O se determina la capacidad que tiene el hidrolizado de colágeno
de combinar el colorante en función del pH partiendo del valor 11,5 donde
tiene lugar la máxima capacidad de combinación. Se seleccionaron las
siguientes condiciones experimentales en las cuales se originan complejos
insolubles 'hidrolizado de colágeno-colorante': relación mg proteína
equivalente/ mg colorante = 2.500; temperatura 40ºC; tiempo de reacción 20
horas con agitación continua; intervalo del pH -en el rango 4,0 -11,5- 0,2/0,3
unidades; medida de la absorbancia a l = 520 nm. Para ajustar los pH iniciales
se utilizaron soluciones de ácido clorhídrico e hidróxido de sodio, midiéndose
también el pH de la solución final (el pH se mantenía prácticamente
constante). No se emplearon buffers ya que se observó que perturbaban la
interacción hidrolizado de colágeno-colorante. El valor de absorbancia en el filtrado, luego
de separar el precipitado formado, se mantuvo relativamente constante por
debajo del rango del pH 5,4 - 5,7. A pH superiores las absorbancias disminuyó
hasta alcanzar el valor mínimo al pH 11,5. Este rango del pH donde tiene lugar
la transición en la capacidad del hidrolizado de colágeno para combinar el
colorante corresponde al punto isoiónico.
punto isoiónico
del hidrolizado
de colágeno = 5,4 - 5,7. Si bien los resultados sobre las interacciones
hidrolizado de colágeno-recurtientes/colorantes serán considerados en la
segunda parte de la línea de investigación sobre el uso del hidrolizado de
colágeno en los procesos de poscurtición en esta sección se incorpora un
ejemplo de interacción hidrolizado de colágeno con un colorante aniónico
para cueros para mostrar el comportamiento del hidrolizado en el rango de pH de
su punto isoiónico y a valores inferiores a él (zona del pH en los procesos
de poscurtición). Se aplicaron las mismas condiciones
experimentales utilizadas para la Safranina O en la reacción entre el
hidrolizado de colágeno y un colorante aniónico utilizado en el proceso de teñido
de cuero (Negro NL Teac s.a.) a diferentes pH. Como se observa en la Figura 4
el hidrolizado de colágeno aumenta su capacidad de combinación con el
colorante (valores de absorbancia en el filtrado menores) a partir del rango de
pH 5,5-5,9 hacia pH inferiores; este rango se corresponde con la zona del punto isoiónico
determinado con la Safranina O. Los valores experimentales fueron ajustados con
un polinomio de orden 3. Los procesos de poscurtición (recurtido,
engrase y teñido) finalizan a pH 3,6 - 4,0 , es decir a pH inferiores al punto isoiónico
del 'cuero cromo' y también al correspondiente de la "piel soluble",
lo cual promueve las reacciones de ésta con los recurtientes, nutrientes y
colorantes. Las gelatinas 'álcali-precursor' de varios orígenes
tienen un punto isoeléctrico en el rango del pH 4,82 - 5,10 [27, pág 108], es
de esperar entonces que la hidrólisis avanzada de la gelatina conlleve a un
hidrolizado cuya mezcla de polipéptidos mantenga un punto isoeléctrico en el rango ácido. Contenido de cromo total El contenido de cromo total del hidrolizado de
colágeno fue determinado siguiendo el procedimiento de los "Standard
Methods for the Examination of Water and Waste Water, 18th Edition 1992, Method
3500-Cr D".
valores
comprendidos entre 0,10 - 0,25 mg Cr/g sólidos totales
0,15
- 0,35 mg Cr/g proteína equivalente En la Tabla IV se presenta una compilación de
los datos del hidrolizado de colágeno elaborado en CITEC obtenidos con el
protocolo de análisis que se expone en el presente trabajo.
Tabla
IV
Caracteríticas
del hidrolizado de colágeno obtenido de la hidrólisis alcalina-enzimática de
las virutas de cromo |
